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一、靈芝菌絲體被成為“靈芝胎盤”，由靈芝孢子萌發形成菌絲(靈芝菌絲不斷地分解，吸收養份，在合適的光照，空氣，溫度等其它條件配合時就形成了靈芝子實體。子實體成熟后彈射孢子粉，也就形成了靈芝的生活史，靈芝子實體所需要的構成物質，有一半以上的營養物質來源于菌絲體中的貯存養份)，靈芝菌粉具有靈芝相同的有效成分，其中粗多糖及靈芝多糖和蛋白質的含量遠遠高于天然靈芝，該品及相關制劑可寧心安神、健脾和胃。用于失眠健忘、身體虛弱、神經衰弱等。靈芝菌絲發酵粉，輔助治療效果較靈芝、靈芝粉要好，有時作用效果和破壁靈芝孢子粉差不多。靈芝菌發酵菌絲體，烘干粉碎，價格優惠質量好。

二、靈芝菌粉發酵工藝：

　靈芝是我國古代勞動人民用之已久的一類珍貴的藥用真菌，具有補中、固腎、補肺、止血的 功 用，對多種慢性病有一定療效。靈芝多糖對肉瘤 s180、腫瘤 ah-b，埃利希氏腹水 瘤及腺瘤具有明顯的抑制活性，并能迅速恢復和提高機體免疫能力，治療愛滋病的報道更引 人矚目，掀起了一場“靈芝研究熱”［1］。

　　靈芝及其多糖廣泛應用在醫藥、食品等領域，市場需求量與日俱增，但目前靈芝多糖的生產 幾乎都是從子實體中提取，靈芝野生資源缺乏，人工栽培的周期長(2～3個月以上)，占地面 積大，又受季節限制，從而影響了靈芝的充分利用，而利用深層培養技術生產靈芝，周期短 (7～10 d)、成本低、產量大，具有工業化的生產前景，選取合適的培養基、適當的分離純 化方法，提取靈芝多糖是本研究的終目的。我們對發酵培養基優化及靈芝多糖提取的工藝 進行了深入研究，不僅多糖獲得了分級分離，而且對多糖組成成分也進行了分析。

　　1　靈芝培養基的優化

　　1.1　菌株：紫芝 g989菌株由中國輕工食品發酵研究所提供。

　　1.2　優化培養基的篩選：將保存的菌種從4 ℃的冰箱中取出，在28 ℃下活化，然后在 無菌操作臺上用接種針將母種接至pda培養基上，置于培養箱中(28 ℃以下)培養1 周。然后 將其接種至種子培養基中，放置于搖床上(28 ℃，120 r/min)發酵1 周。下搖床后，將種子 接到正交實驗培養基中發酵1 周(見表1)。

表1　正交實驗優化培養基

瓶號 碳源 氮源 起始

　　ph值
菌絲體

　　干重(g)
粗多糖

　　干重(g)

1# 3.6%葡萄糖 0.4%蛋白胨 5.0 1.562 0 0.071 9
2# 3.6%葡萄糖 0.4%黃豆粉 6.0 1.020 2 0.057 2
3# 3.6%葡萄糖 0.4%硫酸銨 7.0 0.460 3 0.016 4
4# 3.6%蔗糖 0.4%蛋白胨 6.0 0.599 8 0.006 7
5# 3.6%蔗糖 0.4%黃豆粉 7.0 0.489 3 0.039 8
6# 3.6%蔗糖 0.4%硫酸銨 5.0 0.387 3 0.019 9
7# 3.6%麥芽糖 0.4%蛋白胨 7.0 1.358 3 0.044 2
8# 3.6%麥芽糖 0.4%黃豆粉 5.0 1.274 1 0.047 6
9# 3.6%麥芽糖 0.4%硫酸銨 6.0 0.572 9 0.047 1

　　接種量：8 毫升/瓶；搖床轉速：120 r/min；溫度：28 ℃；其余成分：kh2po4 0.1% ，vit b1 0.005%，mgso4*7h2o 0.05%。

　　將 1 周后的發酵液離心(20 ℃，3 000 r/min)10 min，離心后的上清液在水浴鍋中濃縮 (60 ℃)，濃縮液中加入等體積 85% 工業酒精沉淀，放置于冰箱中過夜。然后將濃縮液 離心(20 ℃，3 800 r/min)，將離心的沉淀物放置于烘箱中(80 ℃以下)， 烘干并稱重，即得 胞外粗多糖產量。離心后得到的菌絲體放置于烘箱中(80 ℃以下)烘干，稱重。

　　1.3　發酵參數的測定：利用 dns 法測定發酵液中還原糖的變化［3］，利用蒽酮法 測定發酵液中總糖的變化［4］；利用甲醛滴定法測定發酵液中氨基氮的變化［ 5］；以及利用 ph 計測定發酵液中 ph 值的變化。

　　1.4　靈芝的菌絲體形態：本實驗用 h-800 透射電鏡對靈芝菌絲體的形態進行觀察(如圖1 所示)，靈芝菌絲體長勢茂盛，菌絲很飽滿。

圖1　靈芝菌絲體電鏡照片

　　1.5　靈芝胞外多糖的提取分離純化：將依前述方法得到的粗多糖加熱水溶解，然后趁熱真空抽濾，濾液冷卻后加入氯仿與正丁醇 以 4∶1 混合液，攪拌，再離心，離心后取上層多糖水溶液加入活性炭脫色，過濾的清液用 85% 工業酒精沉淀，然后用丙酮，無水乙醇依次洗滌，在真空干燥器中干燥得總多糖。

　　1.6　多糖組分分析［6］：sephadex g-200 柱層析，流速 0.5 ml/min，洗脫劑 為 0.5 mol/l nacl 溶液，多糖用蒽酮法檢測。

　　1.7　多糖組成分析：裁剪 10 cm×23 cm 的新華濾紙，在濾紙的底端 3 cm 處用鉛筆劃線 作為樣品的起點線，用毛細管分別吸取待測樣品及葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖等 單糖溶液，在樣品的起點線上每隔 2 cm 點一個樣，將點好樣品的濾紙懸掛在盛有乙酸乙酯 -水-吡啶(60∶20∶25)展層劑的層析缸中，密閉層析缸飽和，然后將其底部浸入展層，用 苯胺-二苯胺系統顯色(即苯胺 4 g，二苯胺 4 ml,85%的磷酸 70 ml)，用吹風機吹干后， 放置于烘箱中，105 ℃ 烘烤 5 min。其中待測樣品是粉碎后溶于 1 mol/l 硫酸中，封管 ，然后在沸水浴中水解 6 h，加入 baco3，中和硫酸后過濾即得。

　　2　結果與討論

　　2.1　優培養基的篩選：根據對正交實驗培養基發酵所得到的粗多糖及菌絲體進行統計分 析，得出氮源是主要因素，碳源其次，ph 值影響小，并且由于黃豆粉中含糖，影響發酵 參數的測定，而較酸的環境也不利于微生物的生長。故后確定的較優化的組合為：碳源為 葡萄糖3.6%，氮源為蛋白胨0.4%，ph值 6.0，酵母膏 0.2%，kh2po4 0.1%，mgso 4*7h2o 0.05%，vit b10.005%。每升發酵液產干菌絲體 15.6 g，粗多糖產量達 37.5 g /kg 干菌體。

　　2.2　發酵過程中參數的變化：通過跟蹤測定發現發酵過程中還原糖逐漸減少，這是因為靈 芝在不斷地利用還原糖(即葡萄糖)，到發酵終點，葡萄糖幾乎全被利用完。總糖只是在極小 的范圍內波動，即雖然還原糖被不斷消耗了，但還原糖又被轉變為其它的糖類，總糖含量始 終不變；氨基氮先是在很小范圍內變化，然后逐漸降低，因為剛開始靈芝生長緩慢，蛋白質 的生成與消耗幾乎持平，隨后靈芝生長旺盛，蛋白質呈逐漸下降趨勢；ph 值是不斷降低的 ，說明在發酵中有酸類物質分泌到胞外，即靈芝酸。

　　2.3　胞外多糖的分離純化：通過紫外分析可知，我們所得到的靈芝多糖在260 mm及280 mm 處無吸收峰，也就是說無核酸及蛋白質存在，基本上證明多糖無其他雜質，且通過發酵得到 的多糖提取得率為37.5 g/kg干菌體，比文獻報道［2］34.4 g/kg干菌體有提 高。

　　2.4　胞外多糖組分的層析分析：通過凝膠層析所得到的洗脫曲線見圖2。

圖2　胞外多糖的洗脫曲線

　　從圖2可以看出，胞外多糖的成分復雜，分子量大小不一，共有 5 個組分。

　　2.5　多糖的單糖組成分析：

　　2.5.1　紙層析：通過紙層析測定 rf 值與已知單糖比較可知靈芝胞外多糖組分是由葡萄 糖、甘露糖、果糖組成的。

　　2.5.2　胞外多糖紅外分析：通過胞外多糖紅外光譜看出 840 cm-1及 761 cm -1 附近無吸收峰，892 cm-1 處有吸收峰，表明靈芝胞外多糖具有 β-d -糖苷鍵 ；800 cm-1 處有一微弱的吸收峰表明有甘露糖存在；1 110 cm-1 處有吸 收表 明靈芝多糖的單糖為六元環結構；3 400 cm-1 處的強吸收峰為糖分子中締 三羥基的伸縮振動吸收峰。

　　2.5.3　氣相色譜分析：將胞外多糖組分 1 的酸水解液乙酰化后作氣相色譜，其結果如表 2 所示。乙酰化方法是：取 20 mg 靈芝多糖溶于 3 ml 5 mol/l 硫酸中，封管在沸水中 水解 8 h，水解液加入適量 baco3 中和，過濾。濾液中加入 15 mg nabh4，放置過夜 ，然后加入適量乙酸分解過量的 nabh4，重復 4 次。將上面得到的溶液在 105 ℃ 的 烘箱中烘干，冷卻后轉入真空耳塞管，加入 1 ml 乙酸酐，0.5 ml 吡啶，然后在 100 ℃ 下反應 2 h，反應液冷卻后加入 1 ml 水，放入表面皿中蒸發至干。后用 1 ml 氯甲烷提 取，提取液可直接進行氣相色譜分析(見表2)。

表2　胞外多糖的氣相色譜分析

保留時間

　　(min)
峰面積 含量

　　(%)
校正因子
3.232 3973 5.214 1.000e+000
3.813 219 0.287 1.000e+000
4.250 615 0.807 1.000e+000
5.548 71389 93.691 1.000e+000
合計 76196 100.00

　　從表2我們可以看出，靈芝胞外多糖組分1是由3種單糖組成的，結合紙層析的結果可知靈芝 胞外多糖中含有甘露糖、果糖、葡萄糖，其中果糖是首次報道。address: sun dongping, college of chemical engineering, nanjing university of tech nology, nanjing

　　孫東平　男，1970年生，江蘇灌云人，現為南京理工大學化工學院博士研究生，講師，主要 從事糖化學及微生物生理、生化研究工作，發表學術論文多篇，參與國家自然科學基金等多 項科研工作。

參 考 文 獻

　　1，黃為群，吳其威，黃瑞珊，等.上海交通大學學報，1994，28(2)：83

　　2，羅立新，姚汝華，周少奇.食品工業科技，1998，(3)：6

　　3，孫東平.液體發酵紅曲的應用研究.南京大學碩士研究畢業論文，1997：19

　　4，袁玉蓀，朱婉華，陳鈞輝.生物化學實驗.北京：高等教育出版社，1995：13

　　5，袁玉蓀，朱婉華，陳鈞輝.生物化學實驗.北京：高等教育出版社，1995：65

　　6，張承圭，王傳懷，袁玉蓀，等.生物化學儀器分析.北京：高等教育出版社，19 90：203